人肝癌细胞HepG2的培养方法旨在为研究人员提供清晰的操作指南，以确保细胞的健康生长和稳定性。以下是关于HepG2细胞培养的详细说明。

一、细胞培养条件

细胞名称：人肝癌细胞HepG2

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：首次建议1:2传代。每2天换液。

备注：用无菌离心管收集培养基，可用于过渡对比培养。若效果不理想，推荐直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞处理与培养方法

细胞收到后，待其达到良好生长状态，再灌满完全培养液并封好瓶口，这样可以在运输过程中保持细胞的稳定。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放置于超净台内，进行严格的无菌操作。接着将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以帮助细胞状态稳定后再进行处理。

显微镜下观察细胞生长情况，并对不同放大倍数下的细胞情况拍照保存（建议拍摄40x、100x、200x各一张），前三天的照片为售后依据，不提供照片视为收到状态良好。注意：在培养瓶放入培养箱时，请将瓶盖稍微拧松。传代后，建议使用原瓶的完全培养基以及自制的完全培养基进行对比培养。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未超过80%汇合度时，收集瓶内完全培养液至离心管中，留5ml培养基放在37℃、5% CO2孵箱继续培养。如果细胞密度超过80%，可进行如下传代步骤：

1. 弃去上清液，用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放置在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速放回操作台，轻敲培养瓶后加入超过5ml的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶面积达到80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置观察，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃的冰箱。如需转入液氮罐，需在-80℃下存放超过24小时。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管，注意佩戴防护面具，立即置于37℃水浴中解冻，直至无结晶出现，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能由于粘附不牢而脱落，这是正常现象。处理方法为将培养瓶内的培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清用于过渡培养，然后加入1-2ml胰酶进行消化，1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再离心并按照上述步骤进行分瓶传代。

五、售后条款

尊龙凯时承诺在客户遇到细胞问题时的售后服务：1）细胞如因运输问题、污染等造成的损失，符合条件可重发。2）不符合重发条件的情况包括客户操作不当、细胞污染等。具体请参照售后条款进行核实。